美国冒险喜剧电影《博物馆奇妙夜2》，讲述了赖瑞经过第一集的博物馆奇遇后， 以自己名字为品牌的手电筒赚了不少钱，衣食无忧，但心底总是有一点失落感，同时博物馆发生了一件大事，促使赖瑞再次回到了博物馆，继续奇妙之旅。

在第一集之后，夜间警卫赖瑞随即以自己名字为品牌的手电筒赚了不少钱，再也什么都不缺，可是他总觉得心底身处有什么失落了，有个黑暗的阴影不断要拉他回到美国自然历史博物馆，也就是他人生一夕间改变的地方。一件大事突然发生，在那里他最喜欢的展览品，也就是他的好友，被认为已经不符合潮流所需，打包准备送进史密森尼博物馆的仓库。

它们的命运现在是未知数，赖瑞接到一通缩小模型牛仔杰迪·戴亚（欧文·威尔逊饰）紧急求援的电话，通知他这场将席卷而来的灾难。情况似乎是有新来的人，威胁到他们的生存，包括法老王（汉克·阿扎利亚饰），他已经郁闷了三千年之久。现在他和三个历史上最知名的人物伊凡大帝（ 克里斯多弗·盖斯特饰）、拿破仑（阿兰·夏巴饰）与黑道头子艾尔卡彭（乔·博恩瑟饰），正筹划以启动地下世界的军团来接管整个博物馆、接下来是全世界。

赖瑞随即动身赶往华盛顿，他这次有了几个新朋友，有聪明的爱因斯坦、诚恳的林肯、以及总是让他着迷的展览爱蜜莉亚·埃尔哈特（艾米·亚当斯饰），他们激发了赖瑞对于冒险的好奇与热情。加上旧搭档的归队，包括罗斯福（罗宾·威廉斯饰）、乌大维（史蒂夫·库根饰）、萨卡加维亚（肖肖尼印第安人妇女，米苏·贝克饰）、匈奴王（派崔克·盖勒饰）和尼安德塔人……赖瑞必须在破晓之前，将他的好友全数救出，并且让华盛顿National Mall整个博物馆区域，包括林肯纪念厅到太空博物馆，回到宁静的秩序。